超低溫保存的注意事項及面臨的挑戰

冰凍和解凍對大多數細胞都是嚴重的脅迫，通過控制冷凍和解凍的速度以及改變細胞和細胞質的化學環境來改變。冰凍配子和胚胎在人類生育管理上的越來越重要。如下報告將解析超低溫保存的注意事項及面臨的挑戰：

　　在冰凍過程中，主要的脅迫來自：①暴露在低溫下;②冰晶的機械、物理效應;③胞外溶液性質的改變;④胞內溶液類似性質的改變。超低溫損傷的一個原因，可能是細胞本身沒有結冰時溫度下降對細胞結構和功能的影響。若發生這種直接的低溫損傷，則在降溫過程中會很快地表現出來并取決于冷凍速度，隨冷凍速度增加而增加。這種損傷在很多細胞包括細菌、酵母、原生生物、藻類、高等植物和哺乳類細胞系中都可觀察到。

　　在水溶液環境的細胞系統中，冷凍速度慢將導致胞外結冰，而細胞仍未結冰，不過已處于超冷卻狀態(即處于溶液冰點以下，但無冰晶形成)。胞外結冰的主要后果是溶質從冰晶中排出，并在剩余的液體部分積累。這小部分溶液很快積累大量溶質，因而對細胞造成了高滲環境，以致未結冰細胞的滲透脅迫也就增加 (圖1)。細胞的反應表現為失水、體積減少，并且因細胞膜的表面積減少可能遭受一系列機械損傷。這些損傷包括由于細胞收縮引起質膜物質丟失，這可能導致解凍過程中隨著細胞恢復其原來的體積而發生胞溶作用。顯然，在這種低溫脫水過程中，未冰凍細胞的細胞質將更加濃縮，其細胞器將和整體細胞一樣遭受后面損傷性的滲透脅迫效應。細胞外的冰晶和未結冰溶液將同時存在，直至達到溶液的共溶溫度，在這種溫度下，溶質開始晶體化。

　　圖1 不同零下溫度下未結冰水的百分數和未結冰NaCl溶液中溶質的摩爾數;

　　起初NaCl摩爾數為0.15M(引自Grout和Morris，1987)

　　超低溫保存技術將面臨的挑戰：

　　1、要盡可能改進技術線路，以便發展中國家可以立即在農作物的保存和改良、以及生物技術和醫療保健的開發上獲得益處。實現這一目標的重要步驟，就是發展和生產在技術不可靠的條件下性能可靠的廉價冰凍設備。第二步目標是大器官(例如腎)的超低溫保存，以方便移植手術的器官供應。這里面的困難包括尋找適合保存大器官時不可避免的熱傳遞問題。

　　2、用單一方案保存多種類型的細胞不是不能實現，這在生長后期的軟體動物幼體保存中已被證實。這些動物直徑在0.5mm以上，并具有發達的功能肌肉、帶消化組織的內臟、活躍的纖毛和神經、循環組織。由于這些幼體體積小，表面積/體積較大，熱傳遞可能不會受到很大的限制。不過，在更大的器官中例如哺乳動物的腎，傳遞關系很復雜，可能成為冷凍和脫水的重要限制因子。這些物理問題可能比細胞的多樣性、對超低溫保存的成功造成更大的影響。

　　超低溫保存應用：

　　已證明液氮保存適應于一系列細胞、組織和有機體(例如細菌、酵母、血紅細胞、雜交瘤、哺乳動物配子和高等植物培養細胞)，并且已成功地開發其商業價值，特別是牛精子和胚胎，以及近的軟體動物幼體。